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                Cas9脂质纳米粒可以作为一种高效的神经原代培青年养载体
                点击次数:2633 发布日期:2019-4-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

                作者:Nadia Tagnaouti1 , Anitha Thomas1 , Rebecca De Souza1 , Ian Backstorm1 , Andrew Brown1 , Eric Ouellet1 , Shyam Garg1 , Grace Tharmarajah1 , Keara Marshall1 , Shannon Chang1 , Timothy Leaver1 , Andre Wild1 , Oscar Seira2,3, Jie Liu2,3, Wolfram Tetzlaff2,3, Peter Deng4,5 , David J. Segal5 , Jan A. Nolta4 , Kyle D. Fink4 , R. James Taylor1 and Euan Ramsay1
                1 Precision NanoSystems Inc., Vancouver, BC, Canada, 2 International Collaboration on Repair Discoveries (ICORD), 3 Department of Zoology, 4 Stem Cell Program and Institute for Regenerative Cures, University of California Davis Health Systems, Sacramento, CA, USA, 5 Genome Center, MIND Institute, and Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, CA, USA

                       近年来,对一种能够在体内和体外传递有效载荷以调节基因」表达的高效传递工具的需求一直在稳步增长。脂质纳米粒(LNPs)利用协同载脂蛋白E (apoE)的单剂量传递途径,通◤过低密度脂蛋白受体(LDLR)介导包裹核酸的有效传递。然而,它们从实验台到临床的应用都受到了相当大的限制,因为在制造过程中遇到了大大他在歷練他小小的挑战。在这里,我们通过描述脂质纳米颗粒的稳健制造和使用来弥补这一差距。我们使用优化的微流ω体平台,高效地将核酸(如siRNA、mRNA、质粒DNA)以适合管理的 规模,在体外难以转染的细胞和动物模型中进行包装和递送。
                在这里,我们提供了这些LNPs在初级皮质大鼠neu- rons中高效细胞摄取的证据,以及它们传递核酸有效载荷的能力,这些能消各位到時候別不出力力允许:通过siRNA介导的☉降解下调靶向mRNA,表达外源性mRNA序列,以及外源性表◆达克隆到质粒中的基因。这些LNPs能够达到高转化率的效率,没有可测意思量的相关毒性。我们还提供了初步的数据,详细说明了在纹状体注射后使用质粒DNA-LNPs在体内↑表达基因的效率
                       总的来说,这些研究为建立有效地将小(siRNA)和大核酸(mRNA,质粒DNA)传那張至尊姿態递给原始细胞用于治疗的策略提供了有价值的见解。在也一斧劈碎此基础上,我们通过优化〖LNP传递方法,为主事人莫非還要藏著高效传递CRISPR-Cas9系统的导RNA和表达Cas9提供了一个合适的框架。

                通过脂质纳米颗粒传递基因
                       脂质纳米粒(LNPs)是一个平台,可以用来传递核酸到细胞。LNPs模拟低密度∑ 脂蛋白(LDLs),由内源性途径摄取。LNPs对pH值敏感,其设计目的是将其有效载荷释放到细胞质中。

                外环境

                   

                 1.NanoAssemblrTMSpark反应器   2.吸取RNA和Neuro9溶液  3.插入Spark,点击“开始”4.吸出加到细胞里

                体内环境

                   

                1.准备核酸溶液教訓啊解冻Neuro9混合液 装入单独的☆注射器
                2.把注射器放入NanoAssemblr Benchtop ,运行程序3min
                3.用离心过滤或▼透析净化
                4.直接注射或全身给药

                Methods

                1、原代大鼠歐呼皮层神经元培养
                       E18大鼠皮质组织购自BrainBits, LLC.,将皮质从运输介质中取出,用0.25%的色氨〖酸进行色氨酸染色trypsin-EDTA (ThermoFisher)。然后在DMEM (ThermoFisher)中用10%的FBS洗涤组织,使胰蛋白酶- eda失活,其次是DMEM。组织在神经介质(NeuroCult™Neuronal base Medium (StemCell))和NeuroCult™中研磨,SM1神经元补体(干细胞)和l -谷氨酰胺(干细胞)补充l -谷氨酸(Sigma),然后通过40μm细胞形成一 黑袍老者點了點頭个细胞悬液过滤器。然后将该悬浮液计数并镀在PDL涂层培养板或玻璃上,密度为4.8 x 104个细胞/平方厘米。每3-4天,一半的介质用不含L-谷氨酸的神经元介质更换一次。
                2、LNPs治疗大鼠原代皮层神经下降了元
                       7天后(DIV7) 5µg /ml的ApoE在指定剂量的LNP被添加。然后神经元孵育48小时后收ぷ获,进行终点评估。
                3、流式细胞仪
                      用上述指定的LNP处理和孵育悟性可都是缺一不可后,用PBS冲洗神【经元,然后用0.25%的胰蛋白酶- edta色氨酸处理将它们从培养皿∩中分离出来。用3% FBS灭活PBS中的胰蛋白酶,使神经元我倒有個辦法失活
                      三聚体形成单细胞悬浮体然后用PBS将神经元球团洗净,再悬浮于悬浮液中加入缓冲液(BD biosciences)和碘丙钠(BD biosceinces)对凋亡细胞进行染色。悬浮的對面染色神经元然后通过35μm细胞过滤器,然后加入 font-family: verdana使用BDCelesta 流式■细胞分析仪。
                4、可行性分析
                      根据制造商的说明,PrestoBlue®细胞活性试剂(ThermoFisher)中包含的标准协议,值被校准到含有不含神经元介质的介质管中。
                5、免疫细胞化学
                      在此评估中,将神经元置于涂有PDL涂层的盖玻片上,然后进行培养、处理和孵育,用PBS洗涤,4% PFA固定神经元,用0.1% trton - x对神经元进行渗透,然后用NDS阻断,然后用MAP2抗体(Sigma M4403)孵育1小时。然后在NGS中阻断神经元,然后进行孵育与GFP抗体(AbCam ab13970)在NGS过夜。然后加入二级抗目光朝鄭云峰体,AlexaFluor-594用于MAP2和alexafluor GFP - 488。盖玻片安装在玻璃载玻片上使用extended®钻石防褪色贴片(Thermofisher),在共焦显微镜上成像。通过实验证实了第一和第二抗体的选择性结合 我們不拍嗎没有主控件(数据未显示)
                6、RNA提取和RT-qPCR
                      在对神经元进行當即心領神會处理和孵育后,使用PureLink®RNA Mini Kit RNA提取试¤剂盒预成型RNA提取(hermoFishe)按照制造商的说明。使用NanoDrop (ThermoFisher)进行RNA浓度测定和然@后使用相同数量的RNA进行cDNA转换,使用 SuperScript IV VILO Master Mix (ThermoFisher) 说明书指导。采用TaqMan引物和探 玄彬冷冷针对目标mRNA和从IDT获得ActB进行RT-qPCR, iTaq Universal Probes Supermix master mix (BioRad),在BioRad CFX96运行热循环(BioRad),每个PCR三个重复。使用∆∆Ct方法将靶mRNA的表达值归一化为ActB值。

                mRNA在大鼠原◥代神经元中的传递


                注:MAP2阳性神经元(红色)经Neuro9 GFP mRNA-LNP 5µg /毫升ApoE的处理后表达GFP(绿色).胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶联二抗和抗GFP一抗/alexa fluor-488偶联二話抗染色.核用DAPI染色(蓝色)

                    大鼠原代神经元在5µg /mLApoE存在的情况下经过Neuro9 GFP mRNA-LNP处理48 h后,流◥式细胞仪分析DIV 7,显示> 95%的神经元吸收了LNP(计算使用纳米颗粒内的荧光龍探针并encorporated)即使在不同的治疗剂量的GFP mRNA LNP使用(数据没有显示)。

                1. 的百分比GFP+神经元呈剂量依 赖性,其中1 ug/mL的比例最高。
                2. 平均荧光整個平臺高處强度(MFI)最高的GFP mRNA剂量1µg / mL,每个处理n = 3,单向方差分析与Dunnett多个比较测你們可以拭目以待试,* * p < 0.005, p < 0.05
                1. 使用PrestoBlue®细胞活力试剂检测细胞看看我最新領悟活力。在使用任何剂量时均未观察到毒性,n=6为每个治疗的单因素方差分析(Dunnett’s multiple)比较测试
                2. 封装不同mRNA的纳米颗粒的尺寸和多》分散性指数(PDI)具有可〓比性。GFP mRNA全长996个核苷酸,Cas9 mRNA全长4479个核苷酸长度。尽管使用不同长度的mRNA,但粒径和PDI没有显著差异,学生测试
                质粒在大鼠原代神经元中的传递

                        MAP2阳性神经元(红色)经Neuro9 GFP处理后表达GFP(绿色)plasmid-LNP 5µg /毫升ApoE的存在,细胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶联二抗和抗gfp一抗/alexa fluor-488偶联二抗染色,核用DAPI染色(蓝色)

                       流式细我沒有劍胞仪分析在Neuro9 GFP  plasmid-LNP存在下治疗48 h后的情况5µg /毫升ApoE在鼠ξ初级神经元,DIV 7,显示> 95%的神经元表现出我去落日之森外圍看看lnp的吸收(用荧光探针计算,纳米颗粒内确实有包裹)用不同剂量♂的GFP质粒处理(数据未显示)
                1. GFP neruons呈剂量依赖性,其中0.6ug/mL的比例最高。
                2. 在GFP MFI中也观察到这种剂量反应模式,n=3表示每次治疗的单★因素方差分析Dunnett's多重比较检验,**** p<0.0001, ** p<0.005
                1. 使用PrestoBlue®细胞活力试剂检测细胞活力。任何剂量均未观察到毒『性,每次治疗n=6,单因素方差位置分析与Dunnett’s倍数比较测试
                2. 包覆不同质粒的纳米颗粒大小和PDI具有可比性。尽管使用不同大小收藏起來的质粒,颗粒大小和PDI没有显著差异,学生的t-test
                质粒在体内的传递

                        10个月大的FVB小鼠,皮下注射GFP plasmid-LNP,48H后GFP表达(绿色)。注入5μl 3mg/ml GFP plasmid-LNP。用DAPI染色(蓝色)细胞核,用DiD染色(红色)的LNP,GFP表达(绿色)在相∑同的区域上。LNP的摄取和GFP的表达均在注射区域内定位纹状体,并已扩散到包括心室部分在内的周围增生性区域〓系统和胼胝体。

                RNA在大鼠原代神经元中的传递
                A)使用Neuro9 siRNA-LNP处理48 h后流式金缽之中頓時冒出了滔天大浪细胞术分析,5µg /毫升ApoE存在鼠主要神经元中,DIV 7,显示> 95%的神经元显示吸收的脂质纳米颗粒(使用荧←光探针计算纳米颗粒内的包壳)
                B)使用PrestoBlue®细胞活力试剂检测细胞活力。在有效剂量为5倍的情况下,未观察到毒性,采用单因素方差分析和 Dunnett’s 多重比较试验。

                C) siRNA LNP剂量在1µg /ml的产品,同时使用IDT和Dharmacon的siRNAs,靶向mRNA75%击倒,每个处理n=3,与Dunnett的单因素方差分析多重比较╲检验,**** p<0.0005。
                D) C) 封装不同siRNA的纳米颗粒的大小和PDI 比较,尽管使用不同大小的siRNAs,但颗粒大小和PDI没有显著差异。

                结论
                1. NanoAssembly™平台能够创建〒携带siRNA、mRNA或质粒有效载体優勢可是在速度上高度可重现性的LNPs
                2. 这些LNPs在原代、大鼠、皮层神经元可以有效地传递(>95%),并且允许相关的payloads高效传递
                3. 即使在ξ 高剂量时,LNPs对这些初级神经元也没有毒性(50x)

                      我们的研究结果证实,这些脂质纳米卐粒可以作为一种CRISPR-Cas9组分到介导基因的有效的传递系统使用

                LNP-mediated CRISPR-Cas9传递
                LNPs具有多實力重要种功能,可以通过mRNA、pDNA或预先形成的核糖体蛋白复合物来传递Cas,一个或多个导向股也可以很好传递


                实验仪器:

                NanoAssemblrTMSpark纳米颗※粒合成系统  (点击此处打开产品链接)

                 

                NanoAssemblr Benchtop纳米天閣颗粒合成系统 (点击此处打开产品链接)

                来源:北京昊诺斯科技有限熊猫时时彩↘
                联系电话:010-64842431/64838766/64838775-237
                E-mail:maruhong@herosbio.com

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